Extracción de ADN a partir de una muestra de sangre (I):

Introducción

El objetivo de esta practica es hallar ADN partiendo de una muestra de sangre proporcionada por el profesor. Para conseguir un mayor manejo con las técnicas de laboratorio y aparatos de este.

Nos hemos basado en un principio por el cual vamos a desnaturalizar las proteínas de la muestra para que así esta precipite y poder quedarnos con el pellet en la parte de arriba, donde se encuentra el ADN. Pese que estas practicas se pueden ejercer de dos formas distintas, nosotros vamos a realizar la denominada “ Extracción a partir de muestras de 3 ml”.

Materiales

Para realizar estas practicas necesitaremos:

- Isopropanol

- Etanol 70%

- Microtubos de 1,5 Ml, tubos de centrifugada de 15 Ml

- Microcentrifuga

- Vortex

- Baño agua

Protocolo

# Separar las células que contienen ADN de los eritrocitos.

# Realizar la lisis celular ; es decir las células son lisadas con un tipo de detergente.

# Realizar una precipitación de las proteínas por precipitación salina.

# Extraer el ADN con una precipitación con Isopropanol.

# Hidratar la muestra de ADN con agua destilada.

Ejecución

Primero ponemos 300 micro litros de sangre y añadimos 900 micro litros de solución lisis de RBC, lo mezclamos y lo incubamos durante 10 min. Después centrifugamos durante 30 segundo la muestra con una fuerza de 14000 G, para así eliminar el sobresaliente sin afectar al pellet. A continuación suspendemos el pellet del microtubo gracias al Vortex, lo que facilitará el siguiente paso. Añadimos 300 microlitros de solución de lisis y lo suspendemos mediante pipeta para lisar la célula (hay que tener en cuenta que la mezcla no puede tener grumos y a de ser homogénea).

Tras tener la muestra en el estado optimo tuvimos que añadir 100 microlitros de solucion de precipitación proteica y lo metimos en el Vortex durante unos 30 segundos, luego centrifugamos a 16000 G durante 3 minutos y así obtuvimos un precipitado marrón y lo metimos en el congelador durante 5 minutos. Para concluir solo nos quedaba precipitar el ADN, para ello traspasamos el sobrante de la muestra de ADN a otro microtubo con 300 microlitros de Isopropanol, a continuación mezclamos la muestra por inversión ( 50 veces) luego metimos este microtubo en el centrifugador a 16000 G durante dos minutos a fin de que saliese el ADN blanco. No obstante la primera vez que realizamos este paso no conseguimos el objetivo deseado ya que no había una muestra de ADN blanco, tras pedir consejo para saber que hacer revisamos todos los pasos y repetimos este ultimo dos veces no obstante el resultado no cambió, seguimos sin obtener el ADN. Finalmente se acabo el tiempo y no pudimos repetir la practica sin conseguir el objetivo de aislar el ADN.

Este no fue el resultado esperado y pese que revisamos los pasos no hallamos el error por el cual no nos salió la práctica.

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