Realización De La PCR

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sirve para amplificar y cuantificar el ADN. El objetivo principal de esta práctica es conseguir hallar nuestro tipo de grupo sanguíneo (+ o -) a través de una muestra propia de sangre extraída por un personal especializado. Lo someteremos a las técnicas aprendidas en el anterior trimestre como es la purificación de muestras para sacar el ADN y nuevas técnicas aprendidas este trimestre como es la realización de la propia PCR con el equipo necesario tal que pueden destacar el termociclador o la cubeta de electroforesis.

La utilidad de esta técnica es que a partir de una pequeña muestra podemos crear mucho mas cantidad de aquella sustancia que queremos estudiar, normalmente ADN

Aparataje

Entre todos los materiales de uso cotidiano como pueden ser micropipetas, centrifugadores o vortex; cabe destacar la cabina de bioseguridad la cual nos permite trabajar de forma que no contaminemos las muestras con las que estamos trabajando. El termociclador donde metemos las muestras una vez que ya la hayamos purificado, sometiendo a esta a muchos ciclos con temperaturas y tiempo diferentes para aumentar la cantidad de material que queremos analizar. También tenemos la cubeta de electroforesis, sonde se ponen las muestras de ADN con carga y al conectar la corriente estas se desplazaran al polo correspondiente logrando la separación de sustancias. Por ultimo tenemos que destacar la cámara UV, ya que como hemos teñido el gel este se hace muy visible en esta cámara.

Procedimiento

En primer lugar un especialista nos extrajo sangre para así poder trabajar con nuestra propia muestra para sacar el grupo sanguíneo. Una vez que conseguida esta la sometemos a un proceso de purificación, técnica que ya hicimos en el primer trimestre. Todo este proceso lo realizamos con suma precaución y respetando sobretodo la técnica aséptica para no contaminar la muestra. Después pasamos nuestra muestra a tres tubos eppendorf y cada tubo le hecharemos un reactivo diferente; uno de control positivo, uno de control negativo y el otro se queda al natural, solo con la propia muestra. Esto es lo que va a indicar si el grupo es + o -. A continuación pasamos la muestras al termociclador donde se lleva a cabo la multiplicación del ADN gracias a las condiciones que este aporta. En el termociclador se puede quedar todo el tiempo que se deseé ya que una vez que acabe de realizar todos los ciclos se mantendrá a una tempranera óptima para la conservación de la muestra. De mientras que los tubos permanecen en el termociclador, tenemos que preparar el tampón que emplearemos en el siguiente paso con la electroforesis. Esta se hace realizando una dilución del TAE 10X, por cada 10 ml de TAE debemos añadirle 100mL de agua formando así la concentración adecuada para el tampón. Ahora toca hacer los geles de agarosa; para esto realizaremos los siguiente pasos:

En un matraz, verter la cantidad de tampón para completar el volumen del molde a rellenar con el gel.

• Medir la cantidad de agarosa dependiendo de la concentración a la que se quiera obtener el gel. A más concentración, mayor resolución. Por ejemplo, un gel al 2% sería 2 gramos de agarosa en polvo disueltos en 100 ml de tampón.

• Se procede a mezclar la agarosa con el tampón y fusionar los componentes para obtener el gel. Se necesita una fuente de calor como un microondas, que permite realizar el proceso más rápidamente.

• Se enfría el gel para poder verterlo en la cubeta. Siempre hay que acordarse de poner unos límites con cinta para que no se disperse el gel por la mesa y el peine que formará los pocillos. En unos minutos, al enfriarse del todo, se tiene el gel polimerizado.

• Por último se introduce en la cubeta que contiene el tampón, a la misma concentración que el que se ha utilizado para generar el gel.

Una vez hecho todos los preparativos, intentamos practicar un poco la técnica de pipeteo para controlar bien a la hora de poner el ADN en el gel ya que un fallo en este y podemos destruir todas las muestras del gel.

Cuando sacamos las muestras del termociclador preparamos la cubeta de electroforesis; ponemos sel gel de agarosa en medio de la cubeta y empezamos a verter el tampón por cada uno de los lados que poseé la cubeta, hasta que este totalmente llena y sobrepase el gel unos 2 mL. Ahora es cuando pasamos el contenido de los Eppendorf a la cubeta y anotamos el orden, sabiendo así cuales son los controles positivos, negativos y la muestra pura; cada tanto colocaremos en un pocillo un control de escalera.

Tras dejar todo esto hecho se coloca los bornes a la corriente y lo dejamos 20 mins a una potencia de unos 150V, para que así cada muestra se sitúe en el polo correspondiente. Por último como hemos hechado colorante al gel de agarosa pasamos el gel al transiluminador y podemos ver como cada uno se a desplazado; dejando una imagen así:

Imágenes