Extracción de ADN De Sangre (II)

Introducción

En esta práctica vamos a intentar sacar el ADN de una muestra de sangre, proporcionada por el profesor. Utilizaremos las técnicas más simples para este ejercicio pese que existan numerosas técnicas para lograr nuestro objetivo. Este procedimiento se suele hacer en el ámbito poñlicial por ejemplo, utilizando pqueñas manchas de sangre. ; nosotros recurriremos a los protocolos de extracción de ADN más básicos: lisis celular y posterior lisis nuclear, separación de ADN del contenido celular: proteección frente a nucleasas y la purificación del ADN.

Materiales

- Muestra de sangre

- Tampón de lisis

- NaCl 0,9%

- SDS 20%

- Proteina K 20 mg/ml

- NaCl saturado

- Etanol absoluto

- Etanol 70%

- 2 microtubos

- 1 tubo de fondo cónico 15 ml

- Varilla para capturar la mandeja del ADN

- Pipetas pasteur de 3 ml

Procedimiento

Lo primero como siempre preparar las zonas de trabajo y ponernos los EPIs adecuados.

Al comenzar este ejercicio cada grupo preparo una sustancia necesaria para la prectica y después la distribuía por el resto de los grupos; en nuestro caso a nosotros se nos asigno en NaCl saturado. Para hacer esto cogimos la cantidad de NaCl especificada en el protocolo y(3,5g) y le suministramos agua hasta completar 10 ml de disolución, a continuación disolvemos la mezcla utilizando el agitador magnético. Como no ibamos a utilizarlo en ese preciso momento porque no daba tiempo a acabar el ensayo, guardamos la disolución a temperatura ambiente como estaba estipulado.

Una vez conseguido todos los compùestos necesarios para poxer llevar a cabo todos los procedimeintos lo primero fue coger 2 Ml de sangre tipo 2 y añadirle 10 Ml de tampon de lisis, mezclandolo por inversión y lo dejamos reposar en la nevera a 4 g durante 30 min. Luego centrifuugamos la muestra durante 15 minutos a 2500 rpm y eliminamos el sobrenadante utilizando una pipeta pasteur, a continuación añadimos el NaCl 0,9 % hasta los 4 ml y disolverlo completamente y volvemos a centrifugar otros 15 min a 2500 rpm. Luego añadimos al precipitado 500 microlitros de tampon de lisis, 25 de SDS 20% y 2,5 de preteina K, lo agitamos con el vortex y lo dejamos incubar a temperatura ambiente toda la noche.

Añadimos 160 microlitros del NaCl saturado y le damos un impulso del vortex. Luego suministramos dos volumenes de etanol ( a ser posible frío) y lo mezclamos por inversión lentamente para poder apreciar como se forma el ovillo de ADN, después “pescamos” el ovillo con la varilla y la lavamos en un microtubo con un ml de etanol 70%. Para comcluir dejamos secarse el resultado final durante 30 min, dejando la varilla apoyada con cuidao y por último resuspendemos en 300 microlitros de agua destilada.

Gracias a esto hemos conseguido sacar el ADN deseado de la muestra y con una buena concentración. Nosotros cinseguimos realizar correctamente esta practica y obtuvimos los resultados esperados, pese que tuviesemos que hacerlo en dos intentos; causado por una alteración del orden en el primer intento.

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