Detección de maíz transgénico por PCR


Introducción

En esta práctica vamos a ver los principios básicos de la PCR como herramienta de detección de organismos genéticos. Las ventajas que puede aportar esta técnica es la introducción a la creación de plantas con mejores cualidades que las ya existentes, por ejemplo con mayor resistencia contra las plagas o que den fruto más rápidamente. Recordemos que esta practica requiere un nivel de asepsia muy elevado ya que es muy fácil contaminar la muestra d ADN, lo que supondría un resultado negativo al fin d la prueba

Componentes

-Tampón de electroforesis
- Agarosa
- Muestra maíz transgénico
- Kit extracción ADN alimentario
- Control positivo ADN normal
- Control positivo ADN transgénico
- Gelsafe tinción ADN

Preparación de la práctica

Lo primero es preparar la PCR, tenemos que preparar un control negativo de amplificación, por lo que tenemos que colocar 2,5 microlitros de agua de biología molecular en el lugar de ADN y a continuación vamos a preparar un control positivo de amplificación, por lo que debemos colocar otros 2,5 microlitros de control positivo ADN normal y ADN transgénico. Después metemos ya las muestra en la PCR para que se amplifiquen, una vez hayamos acabado de la la PCR podemos sembrar directamente los fragmentos sacados en un gel de agarosa, ya que el colorante actuá como tampón.

Procedimeinto

Lo primero que tenemos que hacer es pesar 200 mg de la muestra en un microtubo y después mezclarlo con 1,2 Ml de tampón CTAB-1, le damos un golpe de vortex y lo incubamos a 70º durante 30 mins. Después hay que centrifugar durante 10 mins, así formará el pellet, recogemos 600 microlitros de sobrenadante y lo colocamos en un microtubo nuevo. Añadimos 300 microlitros de tampón lisis y 25 microlitros de proteinasa K , lo mezclamos bien e incubamos durante 70º 10 mins. Añadimos 225 microlitros de Isopropanol y le sumamos la mitad del líquido en el reservorio y centrifugamos a 10000 RPM durante 60 segundos. A continuación repetimos el paso anterior pero con el líquido restante. Luego colocamos la columna de microspin en un nuevo tubo y añadimos reservorio 500 microlitros de tampón de desinhibición, centrifugamos 12000 RPM durante 60 segundos y eliminamos el líquido. Ahora añadimos 500 microlitro de tampón de lavado y lo centrifugamos a 12000 RPM durante 60 segundos, también hacemos un segundo lavado añadiendo 500 microlitros de tampón lavado en el reservorio y volviendo a centrifugar. Por último centrifugamos a máxima velocidad durante 3 mins para eliminar el etanol, eliminamos el tubo de recogida y añadimos 150mmicrolitros de tampón de elución e incubamos durante dos minutos; centrifugamos a máxima velocidad durante 60 segundos y así ya el microtubo contiene el ADN

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