TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN

Introducción

En esta práctica vamos a realizar una técnica de hibridación empleando el Southern Blot, para emplear la huella genética y así poder realizar un estudio de paternidad. El ejercicio nos plantea una cuestión sobre quién es el verdadero padre de un niño; por ello emplearemos un ADN de la madre, del hijo y de cada uno de los dos posibles padres

Componentes

- Fragmentos estándar de ADN

- ADN madre cortado con enzimas de restricción

- ADN hijo cortado con enzimas de restricción

- ADN padre 1 cortado con enzimas de restricción

- ADN padre 2 cortado con enzimas de restricción

- Practice gel loading solution

- Tampón de electroforesis 50X

- Bote de blue

- Membrana de Nylon

- Papel de filtro para blooting

- Agarosa

- Pipeta de transferencia

- Pipetas de 1 ml estériles

- Probeta 100 ml

Preparaciones previas

Antes de comenzar hay que hacer las preparaciones de las soluciones para transferencia:

· Preparar 1L de Hcl a 0,25M: 21 Ml de Hcl concentrado 12N y 979 ml de agua destilada

· Preparar 2L de solución de desnaturalización ADN alcalina 0,5M NaOh/0,6M NaCl: 1,8L de agua destilada, 40 gr de NaOh y 70 gr de NaCl

· Solución tampón: 540ml agua destilada y 60 ml blue-blot

Procedimiento

Primero tenemos que hacer la electroforesis del gel de agarosa; pasos a seguir:

1- Preparamos el gel de agarosa al 8%, con 6 pocillos

2- Calentar las muestras de ADN congeladas a 65º

3- Sembrar las muestras

4- Colocar las muestras en la cubeta y suministrarle el voltaje necesario

Ahora vamos a hacer el análisis de southeren blot:

1- Después de hacer la electroforesis colocamos el gel en una cubeta con 100 Ml de Hcl que hemos preparado al principio y lo incubamos a temperatura ambiente durante 8 mins. Cuando este tiempo haya pasado, quitamos el ácido y lavamos el gel con agua destilada

2- Hechamos sobre el gel la solución de desnaturalición durante 15 mins, hay que ir agitándolo y luego eliminamos la disolución

3- Utilizamos los otros 100Ml de solución desnaturalizante e incubamos 15 mins más

4- Colocamos una hoja de papel de plástico en una superficie plana y sobre esta vamos a colocar el gel tanto que quede en contacto directo

5- Con cuidado ajustamos la membrana de Nylon al tamaño de gel

6- Recoger con cuidado la membrana por los extremos con las pinzas

7- Liberar la membrana con cuidado y sumergirla durante 5 mins en la solución desnaturalización

8- Recortar el papel de filtro de blotting del mismo tamaño del gel y colocamos el papel de filtro encima del gel con mucho cuidado

9- Permitir la trasferencia progrese durante toda la noche

10- Eliminamos la placa de vidrio,vaso y papel absorbente

11- Volteamos el conjunto de forma que descanse sobre el papel de filtro

12- Uso de rotulador para hacer 6 pocillos de muestras

13- Retiramos la membrana, y desechamos el gel

14- Ponemos la membrana sobre papel, con el ADN boca arriba

15- Marcar la membrana por el lado de ADN con el nombre de los participantes

16- Fijamos el ADN a la membrana, colocando entre dos hojas la membrana

Por último vamos a la detección no-isotópico del ADN:

1- Colocamos la membrana con el ADN en 100 Ml de la solución diluida en Bue blot ADN, durante 10 mins

2- Sacar la membrana y colocamos en 200Ml de agua destilada

3- Cambiar el agua destilada 3-4 veces hasta que la membrana este descolorida

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